上游笔记3: 多重捕获测序？你的Multi来了

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上游笔记3: 多重捕获测序？你的Multi来了

上游笔记3: 多重捕获测序？你的Multi来了

上一篇笔记讲到，多样本或者多模式（比如TCR/BCR+Gene Expression）的10x Genomics数据处理通常会用到cellranger multi来处理数据以及生成表达量矩阵。这里的"multi"，指的是multiplex（多重）或者multimodal（多模态）的意思，这两个都是现代生物学研究中常用的术语。考虑到multiplex的应用更加广泛，本文将主要介绍这个方向。

Multiplexing（多重捕获）简介

Multiplexing，在测序的语境下是指在单次测序运行中同时测序多个样本的过程，是一个非常常用的技术。当样本数目较多、对通量要求较高、或是想消除批次效应 的情况下，multiplexing可以显著降低测序成本和提高测序效率。

例如，在不使用multiplexing的情况下，测序10个样本可能需要10次独立的测序运行。而使用multiplexing技术，我们可以在一次测序运行中完成所有10个样本的测序，大大节省了时间和成本。

具体来说，multiplexing包括三个主要步骤：添加样本标记、混合、测序 。其中最关键的一步就是添加标记，以便于之后可以将每个样本的数据分离出来。这个分离的过程就叫做demultiplexing（解复用） 。

按照multiplexing的步骤反推，demultiplexing需要：

  1. 1. 分析原始测序数据中的标签序列 (又称CMO, cell multiplexing oligos，或HTO, hashtag oligos）。

  2. 2. 根据CMO将测序读段(reads)分配回它们原来的样本。

  3. 3. 对样本序列数据进行下一步处理（比对、定量等等）。

cellranger multi正是用于实现以上步骤的流程。

CMO vs Barcode vs UMI

看到上面的介绍，有些朋友可能有些困惑。不是已经有barcode和UMI了吗？为什么还需要CMO？CMO跟barcode、UMI有什么区别？

让我们先来看一下这三者的主要特征对比：

特征 CMO Barcode UMI
用途 区分样本 区分细胞 区分mRNA分子
添加时机 样本制备阶段 单细胞分离阶段 反转录阶段
长度 较短 中等 较短
位置 细胞表面 cDNA 5'端 cDNA 5'端，Barcode之后

CMO通常是连接到抗体或磁珠上的寡核苷酸（也可以是自由片段，不连接磁珠/抗体），这些寡核苷酸具有特定的序列标签，用于标记不同的样本或细胞群。与细胞悬液混合后，通过磁力或者免疫相互作用与细胞结合，比如BioLegend的TotalSeq系列。

CMO配置示例。来源：10X Genomics

Multiplexing 实验流程

我们来看看CMO具体是怎么使用，又是如何将序列和样本对应起来的：

  1. 1. 样本制备：  在实验开始时，我们给每个样本加上唯一的CMO。这些CMO会与细胞表面的蛋白结合。

  2. 2. 单细胞分离：  当我们使用微流控技术将细胞分离到油滴中时，CMO也会跟随细胞进入同一个油滴。此时的理想情况下，每个油滴中包含了一个细胞（带有CMO）、一个凝胶珠（带有barcode和UMI）、以及反转录所需的试剂。

  3. 3. 反转录，PCR：  在每个油滴中，我们会同时进行两种反应： a) CMO会被扩增并加上特定的接头序列。 b) 细胞内的mRNA会被反转录成cDNA，并加上barcode、UMI和特定的接头序列。 关键在于，这两种产物（CMO和cDNA）会共享相同的细胞barcode 。

  4. 4. 文库制备：  反应完成后，油滴被打破，所有产物被收集在一起。此时，CMO和cDNA产物是混合在一起的，但它们有不同的特征：cDNA产物通常较长，包含基因特异性序列、UMI和barcode 。CMO产物较短，包含CMO特异性序列和barcode 。

  5. 5. 文库分离：  利用CMO和cDNA产物的长度差异，我们可以通过凝胶电泳 或磁珠纯化 等方法将它们分离。这一步是关键，它允许我们将CMO和cDNA产物分开。

  6. 6. 分别测序：  分离后的CMO和cDNA文库被分别进行测序。

  7. 7. 数据分析：  在数据分析阶段，我们首先处理CMO测序数据，建立barcode和样本之间的对应关系。然后，我们分析cDNA测序数据，获得每个barcode对应的基因表达谱。最后，我们将这两部分信息整合，得到每个样本中各个细胞的基因表达情况。

这种方法不仅能够准确地将不同样本的细胞数据分开，还能在数据分析阶段追溯每个细胞的来源，即使样本在早期就被混合在一起。例如，如果一个barcode在CMO数据中对应于样本A的CMO，在cDNA数据中对应于某个基因表达谱，我们就知道这个基因表达谱来自样本A的一个细胞。

Cellranger multi实战

了解了multiplex的原理，我们来看看cellranger multi具体应该怎么运行吧。

准备数据

除了必要的cellranger本体和提前下载好的参考基因组，你还需要：

  • • 测序数据： fastq文件

  • • CMO序列： feature_reference.csv

  • • 配置文件： multi_config.csv

测序数据

刚才提到，multiplexing实验的CMO和cDNA是分开测序的，所以我们会得到两组fastq文件：

fastq/
├── CMO/
│├── run1_CMO_L001_I1_001.fastq.gz
│├── run1_CMO_L001_I2_001.fastq.gz
│├── run1_CMO_L001_R1_001.fastq.gz
│├── run1_CMO_L001_R2_001.fastq.gz
│└──...
└── cDNA/
├── run1_cDNA_L001_I1_001.fastq.gz
├── run1_cDNA_L001_I2_001.fastq.gz
├── run1_cDNA_L001_R1_001.fastq.gz
├── run1_cDNA_L001_R2_001.fastq.gz
└── ...

复习一下fastq的命名规则：

样本 通道(L001/L002等)读序(I1/I2/R1/R2)_组别(001).fastq.gz

我特意把fastq文件的开头改成了run1以避免混淆。因为在multiplex的实验中，这个“样本”部分其实指的是单次测序运行，不一定是跟真实样本一一对应的 。比如，我可以把6个样本混合到一起，分在一次运行的两个不同通道上测序。此时会产生8个CMO的fastq（每个通道分别产生R1，R2，I1，I2）以及8个cDNA的fastq，总计16个文件，但是这一点在fastq文件名上很可能是看不出来的，因为他们的“样本”部分名字可能都是一样的（如上图，都是run1）。如果是正常测序，不做multiplexing，实际应该得到6*4=24个 fastq文件，比做multiplexing多了8个。

CMO序列

除了fastq文件，我们还需要一个csv表格，列出CMO的id、对应的样本、读序中的规律、具体序列，以及用途。

举例，我们用了BioLegend的TotalSeq-A anti-mouse Hashtag系列的CMO。这一系列的CMO结合小鼠的泛细胞表面抗原MHC-I和MHC-II以求尽量覆盖到免疫和非免疫的细胞。在官网查找到对应序列后可生成feature_reference.csv如下：

id,name,read,pattern,sequence,feature_type
A0307,CMO1,R2,^(BC),GAGTCTGCCAGTATC,Multiplexing Capture
A0308,CMO2,R2,^(BC),TATAGAACGCCAGGC,Multiplexing Capture
A0303,PS1,R2,^(BC),CTTGCCGCATGTCAT,Multiplexing Capture
A0304,PS2,R2,^(BC),AAAGCATTCTTCACG,Multiplexing Capture
A0305,PSP1,R2,^(BC),CTTTGTCTTTGTGAG,Multiplexing Capture
A0306,PSP2,R2,^(BC),TATGCTGCCACGGTA,Multiplexing Capture

这里的id我就填了产品的编号，理论上是可以自定义的，只要序列是对的就可以。同理name也可以自定义名称。

read和pattern这两栏要遵循特定的格式，如R2,^(BC)  的意思是，CMO的序列(barcode)位于Read 2的开头(^是regex中字符串开头)。这是最常见的一种情况，10x和BioLegend的CMO都是这个格式。

当然，如果用了其他第三方的CMO，也可能会出现其他格式。举几个例子：

  • • R1,(CB+BC)： CMO在cellular barcode后面，位于R1

  • • R1,(16C+8B)： R1含有16bp长的cellular barcode和8bp长的CMO

  • • I2,^(BC)：  CMO位于I2开头

诸如此类。划重点：首先是CMO所在读序（R1/R2/I1/I2） ，然后位置（开头^，结尾$，不明确无） ，然后长度（可填可不填） ，最后是细胞序列（C/CB）和CMO序列（B/BC）的相对位置（如BC，CB+BC） 。

sequence ,即具体序列，顾名思义，略过。最后一栏feature_type填Multiplexing Capture 。这是Multiplexing的情况，其他情况不固定，比如蛋白丰度填Antibody Capture 。此时CMO就不叫CMO了，叫feature barcode ，也可以理解为CMO是feature barcode的一种。

配置文件

cellranger multi跟cellranger count不同的一点是，它的选项和配置都要另外包含在一个csv中，而不是写在命令行里。

比如以下的 multi_config.csv ：

[gene-expression]
reference,refdata-gex-GRCm39-2024-A/
create-bam,true

[feature]
reference,feature_ref.csv

[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types
run1_cDNA,fastq/cDNA,GeneExpression
run1_CMO,fastq/cDNA,MultiplexingCapture

[samples]
sample_id,cmo_ids
Sample1,A0301
Sample2,A0302
Sample3,A0303
Sample4,A0304
Sample5,A0305
Sample6,A0306

文件结构

文件由几个部分组成，每个部分都以方括号中的标题开始，如[gene-expression]、[feature]、[libraries]和[samples]。每个部分下面是该部分的具体配置项。

1. [gene-expression]

这部分配置与基因表达分析相关的参数。

格式要求：

  • • 每行为一个配置项

  • • 格式为参数名,参数值

可能包含的参数：

 reference,<path-to-reference>
chemistry,<chemistry-name>
expect-cells,<number>
force-cells,<number>
no-secondary,<true/false>
create-bam,<true/false>
...

示例：

[gene-expression]
reference,refdata-gex-GRCm39-2024-A/
create-bam,true

2. [feature]

这部分用于配置额外的feature信息，如抗体标记/CMO序列或CRISPR的guideRNA序列。

格式要求：

  • • 通常只有一行，指定特征参考文件的位置

示例：

[feature]
reference,feature_ref.csv

3. [libraries]

这部分定义了实验中使用的所有测序文库。

格式要求：

  • • 第一行是标题行，定义了列名

  • • 后续每行代表一个文库

  • • 列之间用逗号分隔

必需的列：

  • • fastq_id: 文库的唯一标识符

  • • fastqs: FASTQ文件的路径

  • • feature_types: 文库类型（如Gene Expression, Antibody Capture等）

示例：

[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types
run1_cDNA,fastq/cDNA,Gene Expression
run1_CMO,fastq/cDNA,Multiplexing Capture

4. [samples]

这部分定义了实验中的样本信息。需要注意的是，cmo_ids需要和feature_reference的第一列id对应。

格式要求：

  • • 第一行是标题行，定义了列名

  • • 后续每行代表一个样本

  • • 列之间用逗号分隔

必需的列：

  • • sample_id: 样本ID

  • • cmo_ids: 对应的CMO的ID

示例：

[samples]
sample_id,cmo_ids
Sample1,A0301
Sample2,A0302
Sample3,A0303

注意事项

  1. 1. 文件格式应为纯文本的CSV格式。

  2. 2. 确保所有路径都是正确的，可以是相对路径或绝对路径。

  3. 3. 在[libraries]部分，确保每个文库都有唯一的fastq_id。这也适用于CMO和cDNA，这两个部分应当被看作是独立的文库。

  4. 4. cmo_ids需要和feature_reference的第一列id对应。

命令行运行

cellranger multi --id=cellranger_outs --csv=multi_config.csv --localcores=48 --localmem=128

万事俱备，最后一步就是运行cellranger multi啦！这一步能够定义的选项有：

  • • id: 实验id，也就是最后输出目录的名字

  • • csv: 配置文件的csv，注意路径是否正确

  • • localcores：核心数，我用了48核

  • • localmem：内存占用，我用了128G

cellranger multi 输出解析

运行完成后，cellranger multi 会在指定的输出目录（本例中为 cellranger_outs）中生成多个文件和子目录。以下是一些关键输出及其用途：

  1. 1. outs/per_sample_outs/ : 这个目录包含了每个样本的单独分析结果。对于每个样本，你会看到类似以下的文件：

    • • filtered_feature_bc_matrix/: 包含过滤后的基因表达矩阵

    • • raw_feature_bc_matrix/: 包含原始的基因表达矩阵

    • • cloupe.cloupe: 用于在Loupe Browser中可视化数据的文件

    • • metrics_summary.csv: 包含关键质量指标的摘要

  2. 2. outs/count/ : 包含所有样本合并后的计数矩阵和相关文件。

  3. 3. outs/multiplexing_analysis/ : 这个目录包含了多重测序分析的结果，其中最重要的文件包括：

    • • assignment_confidence_table.csv: 显示每个细胞被分配到特定样本的置信度

    • • tag_calls_summary.csv: 总结了每个样本的细胞数量和标记调用情况

  4. 4. outs/multi/multiplexing_analysis.html : 一个交互式的HTML报告，summarizes提供了多重测序分析的总体情况，包括样本分配、多重标记效率等。

  5. 5. outs/multi/gemgroup_*.html : 每个GEM组的详细HTML报告，包含了质量指标、细胞计数等信息。

  6. 6. outs/multi/config.csv : 运行时使用的配置文件的副本。

对于后续分析，最有用的文件通常包括：

  • • 过滤后的特征-细胞矩阵（filtered_feature_bc_matrix/）：这是进行下游分析（如聚类、差异表达分析等）的主要输入。

  • • 样本分配结果（assignment_confidence_table.csv）：用于了解每个细胞属于哪个样本。

  • • 质量指标摘要（metrics_summary.csv）：用于评估测序质量和实验成功程度。

  • • Loupe文件（cloupe.cloupe）：用于快速可视化和探索数据。

当然，如果你在配置文件中设置了生成bam文件，你还可以通过bam2fastq反向生成每个样本的fastq文件。也就是说，cellranger multi也可以用于分离每个样本单独的fastq。

那么本期笔记就到这里，感谢观看！

Single Cell Upstream Cell Ranger