Rahul Satija总结2025单细胞八大突破

2025单细胞八大突破

2025 Single Cell Genomics Day

在2025年4月25日，Seurat包开发者，纽约大学的Satija实验室在线上举行了第九届Single Cell Genomics Day。Rahul Satija博士分享了8项令人振奋的新进展，涵盖了实验和计算方法的创新。下面，就让我们一起来看看这些新技术吧！

1. 组合液滴条形码技术

Combinatorial droplet-based barcoding

传统10X Genomics技术的一个主要局限是大部分液滴不含细胞，导致试剂浪费和成本增加。UDA-seq等新技术通过巧妙的组合条形码策略解决了这一问题：

• 首先将大量细胞加入10X仪器，使多个细胞进入同一液滴

• 细胞在此过程中保持完整不裂解

• 随后将细胞转移至96孔板中，添加第二个条形码

组合条形码技术（文献见右下角）

这种方法具有显著优势：

• 单通道可获取约15万个细胞的数据（传统方法仅5000-10000个）

• 大幅降低成本（约节省90%）

• 适用于RNA-seq、ATAC-seq及多组学测序

• 已在人类血液、视网膜和肾脏等多种组织中验证有效

2. 全生物体尺度的参考映射Organismal-scale reference mapping

Satija博士总结现有的参考注释方法

随着单细胞数据量的激增，参考映射技术变得越来越重要。当我们做RNA-seq实验时，会将reads映射到参考基因组上，这样可以更容易地解释新数据。对于scRNA-seq，研究人员也有同样的想法。参考映射工具通常分为两类：组织特异性参考和全身参考（如SCGPT、Similarity等基础模型）。然而，这些模型面临训练数据标注不一致的问题。Satija实验室开发的PanHuman Azimuth神经网络采用了统一的细胞本体论，能够：

• 在整个人体范围内一致地注释细胞

• 不受组织类型或测序技术的限制

• 利用来自23个组织的精心策划的训练数据

• 采用层级化、统一的细胞分类体系

该工具已成功映射Tabula Sapiens V2参考数据集和ARC研究所约8500万个人类细胞，处理时间不到一天。PanHuman Azimuth现已开源，支持R和Python，与Seurat和Scanpy兼容，为细胞类型自动化注释提供了可靠工具。

泛人类Azimuth注释工具用法，有兴趣的小伙伴可以试起来了！

3. 无成像空间分析

Spatial Analysis without Imaging

传统空间转录组学（如Slide-seq和Slide-tags）需要复杂的puck测序和显微成像步骤确定条形码珠的空间位置。如何在不进行任何成像的情况下确定条形码的空间位置？研究人员利用了一个巧妙的数学技巧：通过珠子之间的配对距离重建它们的空间位置。就像仅凭城市间距离就能重建美国地图一样，他们引入了"可扩散珠子"作为随机"喇叭"，如果两个珠子能听到同一个喇叭声，那么它们一定很近。

举例：可以从城市距离数据重构美国地图（文献见右下角）

该技术已在小鼠大脑和整个P1头部样本中得到验证。这一进展简化了空间转录组学实验流程，使得获取空间信息的成本大幅降低，有望推动单细胞和空间技术的深度融合。

利用“广播珠子”得到扩散矩阵，重建组织三维结构（文献见右下角）

4. 半渗透液滴系统Semi-permeable droplets

传统液滴系统封闭后无法添加或移除试剂，限制了实验的复杂性。CAGE（capsule with gel envelope，具有凝胶包膜的囊）技术突破了这一限制：

• 创建具有10-15纳米孔隙的F127DA聚合物外壳，封装细胞和试剂

• 允许小分子（酶、短DNA引物、培养基）通过

• 较大分子（cDNA、长核酸）保留在囊内

水凝胶胶囊示意图（文献见右下角）

这一技术支持：

• 在单细胞水平进行多步骤反应和洗涤

• 细胞在囊内生长形成小型克隆

• 对不同囊内的细胞施加不同处理，随后进行分子测定

CAGE技术为单细胞实验提供了新的可能性，特别是对需要长期培养和复杂处理的实验具有重要意义。Klein实验室和其他团队都在bioRxiv上发表了相关预印本，Atroni Biosciences公司也在商业化这一技术。

示例：使用“笼子”技术进行的单细胞测序

5. 样本层面的单细胞分析

Sample-level analysis of single-cell data

单细胞分析通常聚焦于标记个体细胞和细胞类型，但多个研究组意识到，在病例-对照研究中，样本作为整体的分析更具临床意义。这是领域中一个关键挑战：如何超越单个细胞分析，转向样本级分析？

样本级分析的三个关键方向：

• 聚类：细胞聚类对应细胞类型，样本聚类可能对应患者分群或预后差异

• 轨迹：细胞轨迹表示分化过程，样本轨迹可能代表疾病进展或严重程度

• 参考映射：不仅可注释细胞类型，还可预测患者临床结局或治疗反应

scPoli是一个用于样本级分析的变分自编码器框架，它使我们能够在样本级别而非细胞级别进行PCA分析，从而观察不同个体如何基于细胞分布进行分组。

scPoli原理图，对样本/数据集进行聚类整合（文献见右下角）

另一个影响力较大的方法是scLKME，它不关注单个细胞，而是整体考虑样本中的细胞分布密度。在一个对约40名新生儿脐带血的研究中，scLKME学习了样本级别的轨迹，显示出与胎龄强相关的pseudotime，为研究新生儿免疫系统细胞状态密度如何随年龄变化提供了新视角。利用个体级别的伪时序研究发育过程（文献见图）

6. 天然细胞谱系追踪Native cell lineage tracing

构建完整的生物体谱系树是一个重大挑战，因为DNA突变率很低，难以从DNA数据中学习谱系信息。传统上有两种方法：使用慢病毒整合克隆条形码（如Cell Tag），或利用线粒体DNA突变。但这些方法各有局限，无法在原代人类组织中稳健地进行谱系追踪。

传统谱系追踪方法

今年的突破是利用表观突变或细胞表观遗传状态的变化来构建谱系。DNA胞嘧啶碱基可以获得甲基化标记，在细胞分裂过程中可遗传，但每次分裂中甲基化状态有约0.1%的概率发生变化。如果两个细胞具有几乎完全相同的DNA甲基化或表观突变谱，那么它们很可能属于同一克隆，甚至可能是姐妹细胞。

基于表观突变的追踪方法（文献见右下角）

西湖大学的研究人员开发了名为MethylTree（甲基树）的方法，在一个简单的基准实验中，他们重复培养HEK细胞并分成多个孔，然后分析DNA甲基化状态。结果显示，基于DNA甲基化谱的聚类与真实谱系状态惊人地一致。Lars Velton小组的研究也追求类似方法，将技术应用于哺乳动物造血干细胞。当仅对中性位点进行聚类时，开始显现出小组，这些小组被认为是实验中存在的不同克隆或亚谱系。

7. 用AI构建虚拟细胞

Building virtual cells with AI

虚拟细胞是一种可以在计算机中模拟和预测其过去、现在和未来行为的模型。这个想法今年席卷了系统生物学领域。虽然将细胞数字化建模的idea已经存在一段时间，但现在我们有了更好的数据生成方法（单细胞技术）和更好的分析方法（AI）。虚拟细胞的目标是能够进行虚拟实验并预测结果，例如预测细胞暴露于药物或基因扰动后会发生什么。这可能不会完全取代实验，但可以帮助更有效地设计实验。例如，如果有50,000种药物，无法实验测试所有药物，就可以先进行虚拟筛选，然后仅测试预测中最有希望的1,000种。

AI虚拟细胞的应用（文献见右下角）

Prophet 是一个来自Fabian Theis实验室的方法，使用Transformer架构，吸收各种单细胞和扰动数据，旨在可扩展且普遍地预测细胞表型，包括细胞活力、基因表达和形态。例如，他们对大量肺癌细胞系进行了EGFR抑制剂的虚拟筛选，预测了对EGFR抑制的敏感性梯度，并与实际情况进行了比较。虽然这些预测需要高通量验证，但虚拟细胞的总体想法是将这些预测作为初步猜测，用于优先考虑特定细胞系进行实验后续研究、药物开发和治疗。
部分虚拟细胞的框架（文献见图）

Prophet框架（文献见图）

8. 从单细胞数据推断转录因子结合Inferring TF binding from single-cell data

推断单细胞中的转录因子结合和动态一直是一个极具挑战性的问题，因为转录因子与DNA的相互作用较弱且瞬时。最近，Jason Buenrostro（单细胞ATAC-seq的发明者之一）的研究组发现，转录因子结合位点会出现局部染色质可及性（chromatin accessibility）的下降，称为"足迹"（footprint）。他们据此开发了创新算法seq2PRINT，使用深度学习模型，结合DNA序列信息和ATAC-seq数据增强信号，追踪分化过程中的转录因子动态变化或是预测TF结合。转录因子结合位点会出现局部可及性下降，即“足迹”（文献见图）
seq2PRINT方法通过多重模型追踪转录因子动态变化（文献见图）
另一种由Ivan Raimondi和Dan Landau实验室开发的实验策略是D&D-seq（docking and deamination，对接和脱氨），该方法利用二级纳米抗体融合蛋白将强效碱基编辑器招募到转录因子结合的基因组位置。碱基编辑器在基因组中引入永久性的C>U突变，然后可以在单细胞ATAC中检测这些编辑事件。这种方法的缺点是数据相对稀疏，每个细胞测量的结合事件少于100个，因此需要测序大量细胞并按细胞类型进行pseudobulk。但随着成本下降和大规模实验变得更加可行，这些计算和实验方法将使我们更接近这一令人兴奋的目标：能够以单细胞分辨率探索转录因子结合动态。
D&D-seq 通过永久性的碱基编辑标记TF结合事件（文献见图）

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