跟着Theis Lab学单细胞: 单细胞测序概述

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跟着Theis Lab学单细胞: 单细胞测序概述

跟着Theis Lab学单细胞: 单细胞测序概述

Cracking single-cell analysis with Theis Lab

系列编号：No.02 | 发布日期：2024-12-13 | 预计阅读：15分钟

单细胞最佳实践02.单细胞测序⭐️本章导读 ：

  1. 细胞学说简述

  2. 第一二三代测序技术简史

  3. RNA测序的原理

  4. 单细胞测序的主流方案

2. 1 生命的基本构成单元

细胞是所有生命的基本单位。从某种意义上说，细胞就像一个精密的小工厂，它能维持自身平衡、进行新陈代谢、生长、适应环境、繁殖、对刺激做出反应并进行自我组织 。这个“小工厂”最早是在1665年由英国科学家Robert Hooke发现的。当时他用一个非常简陋的显微镜观察了一片软木切片，惊奇地发现切片看起来像蜂窝一样，于是他把这些小单位命名为“细胞”(cell)。

1839年，Matthias Jakob Schleiden和Theodor Schwann首次提出了细胞学说。这个理论指出：所有生物都是由细胞构成的；细胞是生命活动的基本单位；所有细胞都来源于其他细胞 。

自从细胞学说提出以来，科学家们又发现：

  • 细胞内存在能量流动

  • 遗传信息以DNA的形式在细胞间传递

  • 所有细胞的化学组成都基本相似

细胞主要分为两种类型：真核细胞 和原核细胞 。

  • 真核细胞有一个由核膜包围的细胞核，里面存放着染色体

  • 原核细胞只有一个核糖体区，没有真正的细胞核

“真核”这个词的来源很有意思：nucleus在拉丁语中是“核心”或“种子”的意思 。真核生物可以是单细胞的，也可以是多细胞的，而原核生物都是单细胞的。真核细胞的另一个特点是有很多被膜包围的细胞器，每个细胞器都执行特定的功能。

相比原核细胞，真核细胞的体积要大约10000倍。它们内部结构丰富，有各种细胞器 和由微管、微丝及中间纤维构成的细胞骨架 。细胞核里的DNA复制机制负责读取遗传信息并进行自我复制，维持生命周期的运转。

真核生物的DNA被分成几个线性的染色体。在细胞分裂时，这些染色体会通过微管纺锤体分开。理解DNA中隐藏的遗传信息对于研究进化和疾病相关的过程至关重要。测序就是一种破译DNA核苷酸序列的过程，它可以用来：

  • 找出基因和调控元件在DNA分子和基因组中的位置和功能

  • 发现基因特征，如开放阅读框(ORFs)或CpG岛(这些通常指示启动子区域)

  • 进行不同物种间的DNA序列比较研究进化关系

  • 研究突变与疾病或抗病性之间的关联

举个例子来说，镰状细胞病就是一组红细胞疾病，是由携带氧气的血红蛋白出现异常引起的。这会导致多种严重的健康问题，包括：

  • 疼痛

  • 贫血

  • 手脚肿胀

  • 细菌感染

  • 中风

这种疾病的原因是患者从父母各继承了一个异常的β球蛋白基因(HBB)。具体来说，是β球蛋白基因中的一个GAG密码子变成了GTG，导致第6位氨基酸从谷氨酸变成了缬氨酸(E6V突变)，从而引发了上述疾病。

不过要注意的是，并不是所有疾病都能找到这么简单的单个核苷酸突变与疾病的关联。因为大多数疾病是由复杂的调控过程引起的。

图2.1 罗伯特·胡克的软木细胞图。图片来自《显微镜志》

2. 2 测序技术的简史2.2.1  第一代测序

虽然DNA早在1869年就被Friedrich Miescher分离出来了，但科学界花了100多年才开发出高通量测序技术。以下是一些重要的里程碑：

  • 1953年：Watson、Crick和Franklin发现DNA的双螺旋结构

  • 1965年：Robert Holley测序出第一个tRNA

  • 1972年：Walter Fiers首次测序出完整的基因(MS2噬菌体的外壳蛋白)

  • 1970年代：Sanger开发了**“链终止法”**(也就是我们常说的“Sanger测序”)

  • 1987年：Leroy Hood和Michael Hunkapiller开发了ABI 370仪器，实现了Sanger测序的自动化

Sanger测序的主要优缺点如下：

优点

  • 操作简单,价格适中

  • 准确率很高(<0.001%的错误率)

缺点

  • 只能测序300-1000个碱基的短序列

  • 开头15-40个碱基质量通常不太好(因为这里是引物结合的地方)

  • 700-900个碱基后测序质量会下降

  • 如果测序的DNA片段是克隆的,可能会混入载体序列

  • 每个碱基的测序成本比二代、三代测序要高

2.2.2 第二代测序

1996年，Mostafa Ronaghi、Mathias Uhlen和Pȧl Nyŕen推出了一种新的DNA测序技术：焦磷酸测序法(Pyrosequencing)， 这标志着第二代测序时代的开始。第二代测序(也称为下一代测序，NGS)的实现主要得益于三个方面的进步：

  • 实验室自动化

  • 计算机的应用

  • 反应的微型化

焦磷酸测序通过测量测序过程中产生的发光信号来工作，这个过程也被称为“边合成边测序(sequencing-by-synthesis) ”。

两年后，Shankar Balasubramanian和David Klenerman在Solexa公司改进了这个技术，开发出了使用荧光染料的新方法。这项技术后来成为了Illumina测序仪的基础，也是目前市场的主导技术 。

其他重要的里程碑包括：

  • 2005年：Roche 454测序仪问世，首次将焦磷酸测序过程完全自动化

  • 2007年：SOLiD系统推出“边连接边测序(sequencing-by-ligation)” 技术

  • 2011年：Life Technologies推出Ion Torrent,使用“边合成边测序”检测DNA合成过程中产生的氢离子

第二代测序至今仍被广泛应用，以下是它的优缺点：

优点

  • 试剂成本相对较低

  • 可以处理稀少的样本材料

  • 检测低频变异的灵敏度高

  • 基因组覆盖度全面

  • 通量高,可以多样本并行

  • 能同时测序数千个基因

缺点

  • 仪器昂贵,通常需要多人共用

  • 设备体积大,不适合野外工作

  • 产生的读段(reads)较短，不利于新基因组的组装

  • 测序结果的质量依赖于参考基因组

2.2.3 第三代测序

第三代测序(现在也称为下一代测序)带来了两个重要创新：

  1. 长读长测序 ：相比Illumina的短读长(75-300bp),可以获得更长的核苷酸片段。这对于没有参考基因组的物种特别重要。

  2. 实时测序 ：结合便携式测序仪,使得测序不再局限于实验室,可以进行现场测序。

主要技术代表 ：

  1. PacBio测序(2010年)：

  • 使用纳米孔技术

  • 每个读长通常有8-15kb,最高可达70kb

  • 可以直接观察单个核苷酸的掺入

  1. Oxford Nanopore测序(2012年)：

  • 推出便携式测序仪GridION及其继任者MinION和Flongle

  • 读长可超过2Mb

  • 仪器小到可以放在手掌中

  • 通过观察核酸通过蛋白质纳米孔时产生的电流变化来识别序列

第三代测序补全了第二代测序在长读长方面的劣势，但是同样也有缺点：

优点

  • 长读长有助于组装大型新基因组

  • 设备便携，适合野外工作

  • 可以直接检测DNA和RNA的表观遗传修饰

  • 测序速度快

缺点

  • 错误率比第二代测序高

  • 试剂成本一般比第二代测序贵

2. 3 NGS(下一代测序)流程概览

尽管存在多种NGS技术，但测序DNA（以及反转录后的RNA）的基本步骤大致相同。主要区别在于各种技术使用的测序化学原理不同。

测序的三个主要步骤 ：

  1. 样品制备和文库构建 ：

  • 首先将DNA样品打断成片段

  • 连接接头分子，这些接头有两个作用：

    • 帮助DNA片段与测序芯片结合

    • 提供引物结合位点

  1. 扩增和测序 ：

  • 将文库转化为单链分子

  • 通过扩增步骤(如PCR)产生DNA分子簇

  • 在一次测序运行中，所有分子簇同时进行独立反应

  1. 数据输出和分析 ：

  • 不同测序仪输出格式不同：

    • 有些产生荧光信号

    • 有些产生电信号

  • 原始数据量通常很大

  • 需要复杂的计算处理

2. 4 RNA测序

到目前为止，我们主要讨论的是DNA测序。但仅仅知道DNA序列和调控元件的位置，并不能告诉我们细胞实时的动态运作 情况。例如，同一个基因可以通过不同的mRNA剪接方式产生多个蛋白质，而剪接变异可能导致酶失去功能，引发疾病。这就是为什么我们需要RNA测序(RNA-Seq) 。

RNA-Seq的基本流程与DNA测序类似，但需要一个额外的反转录 步骤，将RNA转换为cDNA。通过RNA测序，研究人员可以获得细胞、组织或生物体在测序时刻的"快照"，即基因表达谱(Transcriptome) 。这些信息可以用来检测多种情况下的变化，比如疾病状态、药物反应，以及不同环境条件下的基因表达变化。

与传统的基因表达检测方法(如微阵列和RT-qPCR)相比，RNA测序有一个显著优势：它不需要提前设计探针。这意味着RNA测序可以无偏见 地对转录本进行采样，让我们能够发现：

  • 新的基因异构体

  • 基因融合现象

  • 单核苷酸变异

  • 其他意想不到的转录特征

这种不受先验知识限制的特性使得RNA测序产生的数据集特别适合进行探索性分析，帮助我们发现新的生物学现象。

2. 5 单细胞RNA测序2.5.1  概述

RNA测序主要有两种方式：混池测序(bulk sequencing)和单细胞测序(single-cell sequencing)。混池测序是将所有细胞的RNA混在一起测序，这种方法通常更便宜也更容易操作。但它也有明显的局限性：它只能得到所有细胞的平均表达水平 ，可能会掩盖一些重要的细胞异质性。

举个例子：在肿瘤研究中，可能存在极少数的耐药细胞导致复发，但这些细胞的特征在混池测序中很难被发现，即使是在培养的细胞中也是如此。为了揭示这种细胞间的差异，我们需要在单细胞水平上检测基因表达，这就是单细胞RNA测序(scRNA-Seq)的用武之地。

不过，单细胞测序也面临着一些挑战：

  • 实验成本通常更高

  • 操作更加复杂

  • 由于分辨率更高，数据分析也变得更加复杂，更容易得出错误的结论

单细胞实验的基本步骤 与混池RNA测序类似，都需要：

  • 细胞裂解

  • 反转录

  • 扩增

  • 最终测序

但单细胞测序还需要额外的步骤：

  • 细胞分离

  • 将细胞分到不同的反应室

  • 或其他形式的细胞标记，以便后续能将测序结果对应到原始细胞

这也是为什么不同的单细胞测序方法主要在这几个方面存在差异：

  • 单细胞分离方式

  • 转录本扩增方法

  • 测序策略

在详细介绍这些不同方法之前，我们先来了解一下转录本定量的过程。

2.5.2 转录本定量

转录本定量是指将原始数据转换成基因表达矩阵的过程。在混池测序中，这个矩阵显示每个基因在每个样本中的表达量；而在单细胞测序中，则显示每个基因在每个细胞中的表达量。这个计算过程的详细内容我们会在下一章讨论。

目前主要有两种转录本定量方法：全长测序(full-length) 和标签测序(tag-based) 。

全长测序 试图均匀地覆盖整个转录本，而标签测序 只捕获转录本的5'端或3'端。分析人员必须了解使用的是哪种方法，因为这直接影响到可以检测到哪些基因。

全长测序

  • 仅限于基于孔板的方案

  • 文库制备方式类似于传统RNA测序

  • 虽然目标是均匀覆盖，但实际上可能仍有区域偏差

  • 最大优势是能够检测剪接变体

标签测序

  • 只测序转录本的3'或5'端

  • 优点是可以使用独特分子标识符(UMIs)

  • 缺点是难以区分不同的剪接异构体

  • 但能更好地解决PCR扩增偏差问题

UMIs的重要性 ：转录本扩增是任何RNA测序实验中的关键步骤，因为我们需要足够多的分子用于质控和测序。在PCR过程中，相同的原始分子会被复制多次。由于这些拷贝与原始分子无法区分，确定样本中原始分子的数量就变得很困难。UMIs正是解决这个问题的有效工具。

UMIs就像分子的“身份证”，是在文库制备时加入的短随机核苷酸序列。它们必须在扩增之前添加到每个分子上。这个设计让我们能够：

  • 准确识别PCR重复

  • 消除扩增偏差

  • 更准确地进行基因表达定量

2.5.3 单细胞测序方案

目前主要有三种单细胞测序方案，它们主要的区别在于细胞分离的方式：

  1. 微流控设备法 ：将细胞包裹在水凝胶液滴中

  2. 孔板法 ：将细胞物理分离到微孔板中

  3. Fluidigm C1微流控芯片法 ：自动将细胞装载和分离到小型反应室中

这三种方法在转录本回收率、测序细胞数量和其他方面都有所不同。让我们来详细了解每种方法的特点。

微流控设备法

目前最广泛使用的微流控方案包括：

  • inDrop

  • Drop-seq

  • 10x Genomics Chromium（商业化产品）

这些技术每秒可以生成数千个液滴，使得它们能以相对较低的成本处理大量细胞。

工作原理 ：虽然这些方法在细节上有所不同，但基本流程是：

  1. 设计特殊的nL(纳升)级液滴，同时捕获细胞和带有引物的微珠

  2. 引物通常包含：

    • PCR手柄序列

    • 细胞条形码

    • 4-8bp的UMI序列

    • poly-T尾（或在5'试剂盒中是poly-T引物）

  3. 当细胞在液滴中裂解时：

    • mRNA立即被释放

    • 与珠子上的带条形码的寡核苷酸结合

  4. 后续处理：

    • 收集并打破液滴

    • 进行PCR和反转录

    • 通过tagmentation添加测序接头

值得注意的是，微流控方法通常只能回收细胞约10%的转录本 ，但这个水平已足够用于可靠的细胞类型鉴定。

让我们来看看不同微流控方法之间的具体差异和特点：

珠子材料的影响 ：

  • Drop-seq使用脆性树脂珠，导致珠子按泊松分布被包裹

  • inDrop和10X Genomics使用可变形的珠子，能达到超过80%的珠子包裹率

  • 珠子材料也影响反转录的位置：

    • Drop-seq在液滴外进行反转录

    • inDrop和10X在液滴内完成反转录

性能对比 （基于Zhang等人2019年的研究）：

1. 条形码质量 ：

  • 10X Genomics表现最好：

    • 有效条形码读数比例达75%

    • inDrop仅25%

    • Drop-seq约30%

2. 灵敏度 ：

  • 10X Genomics：平均捕获17000个转录本，来自3000个基因

  • Drop-seq：捕获8000个转录本，来自2500个基因

  • inDrop：捕获2700个转录本，来自1250个基因

3. 技术噪音 ：10X Genomics最低，其次是Drop-seq，inDrop最高

4. 基因捕获偏好性 ：

  • 10X Genomics：倾向于捕获较短和GC含量较高的基因

  • Drop-seq：更偏好GC含量较低的基因

成本考虑 ：

  • 10X Genomics的性能虽然最好，但每个细胞的成本约是其他方法的两倍

  • Drop-seq除了珠子外都是开源的，可以根据需要调整协议

  • inDrop完全开源，包括珠子都可以在实验室制备，最灵活

微流控方法的总体优势 ：

  • 可以经济高效地测序大量细胞

  • 适合研究组织的整体组成

  • 有助于发现稀有细胞类型

  • 可以使用UMIs

局限性 ：

  • 与其他方法相比转录本检出率较低

  • 只能获得转录本的3'端或5'端，不是全长转录本

孔板法

孔板法是通过将细胞物理分离到微孔板 中进行测序。这种方法的第一步通常有两种选择：

  1. 流式细胞分选(FACS) ：

  • 根据特定的细胞表面标记对细胞进行分选

  • 可以预先富集感兴趣的细胞群

  1. 显微操作 ：
  • 直接用微量吸管将细胞转移到微孔中

分选后的细胞被放置在含有裂解缓冲液的独立微孔中，随后进行反转录。这种方法在单次实验中通常可以分析几百个细胞，每个细胞可以捕获5000-10000个基因。

主要的孔板测序方案包括 ：

  • SMART-seq2

  • MARS-seq

  • QUARTZ-seq

  • SRCB-seq

这些方案的主要区别在于它们的多重测序能力。例如：

  • MARS-seq提供三层条形码系统（分子、细胞和板级标签），具有强大的多重测序能力

  • SMART-seq2不支持早期多重测序，限制了细胞数量

  • QUARTZ-seq2在每个细胞的基因捕获数量上表现最好

根据Mereu等人2020年的研究，QUARTZ-seq2在基因捕获量上优于其他方法，这意味着它能更好地捕获细胞类型特异的标记基因，有助于准确的细胞类型注释。

孔板法的优势 ：

  1. 每个细胞的基因捕获量大，有利于深入表征

  2. 可以在文库制备前收集额外信息：

    • 通过FACS获得细胞大小信息

    • 记录荧光标记强度

  3. 支持全长转录本测序

局限性 ：

  1. 通量受限于单个处理单元

  2. 片段化步骤会丢失链特异性信息

  3. 部分方案需要大量移液步骤：

    • 容易引入技术噪音

    • 可能产生批次效应

Fluidigm C1系统

Fluidigm C1是一个商业化的微流控芯片系统，能够自动将细胞分离到小型反应室中。这个系统的主要特点是将RNA提取和文库制备步骤整合到一起 ，显著减少了人工操作。

工作原理和特点：

CEL-seq2和SMART-seq(第一版)都采用了Fluidigm C1芯片作为其工作流程的一部分。这种整合带来了两个主要优势：

  1. RNA提取和文库制备步骤可以一起完成，大大减少了人工操作

  2. 由于扩增步骤是在独立的反应室中进行的，可以实现全长测序，有效降低了许多其他单细胞RNA测序方案常见的3'端偏差

该系统要求细胞混合物要相对均匀 ，因为细胞会根据大小在芯片上分布到不同位置，这可能会引入位置偏差。由于扩增步骤是在独立反应室中进行的，这种方法能有效降低3'端偏差，这是其他单细胞RNA测序方案常见的问题。

优势：

  1. 支持全长转录本测序

  2. 能够检测剪接变体

  3. 可以研究T/B细胞受体的多样性

局限性：

  1. 每次测序的细胞数量限制在800个以内

  2. 每个细胞的成本比其他方法高

  3. 只能捕获约10%的提取细胞，这使得它不适合研究稀有细胞类型

  4. 芯片只能捕获特定大小范围的细胞，这可能会影响转录本的代表性

纳米孔法

随着长读长测序技术的发展，纳米孔测序为单细胞研究带来了新的可能性。不过，这项技术在单细胞领域的应用还面临着一些独特的挑战。

基础问题：UMI的困境

长读长单细胞测序面临的最大挑战之一是UMI的使用。由于以下原因，这个问题变得特别棘手：

  • 大多数方法很难有效使用UMI

  • 纳米孔测序本身的错误率较高

  • 这些错误可能导致同一个分子的reads被错误地识别为来自不同分子

为了解决这些问题，科研人员开发了两种创新方案：

1. ScNaUmi-seq技术

这是一种混合测序策略，具体包括：

  • 同时使用Nanopore和Illumina测序

  • 利用Illumina的高准确性来验证条形码

  • 工作原理：

    • 比对两种测序在相同区域的序列

    • 用高准确度的Illumina数据来校正Nanopore的条形码序列

  • 缺点是需要建立两个测序文库，增加了实验成本和复杂度

**2. scCOLOR-seq技术

这是一种纯计算方法的解决方案：

  • 利用核苷酸互补配对原理来验证条形码

  • 设计了特殊的错误校正算法

  • 采用改进版的UMI-tools来处理序列重复问题

  • 优点是不需要额外的测序平台

优势：

  1. 全长转录本信息

    • 可以看到完整的剪接模式

    • 能检测序列变异

    • 有助于研究转录本异质性

  2. 实时测序能力

  3. 设备便携性好

局限性：

  1. 成本问题

    • 试剂费用高

    • 某些方案需要双平台测序

  2. 技术问题

    • 条形码错误率高

    • 需要复杂的数据处理流程

  3. 标准化问题

    • 不同批次间的数据可比性

    • 质控标准的建立

这项技术虽然还在不断发展中，但已经展现出巨大的应用潜力，特别是在研究复杂的转录本结构和变异方面。随着技术的进步和成本的降低，它可能会成为单细胞测序的重要补充方法。

我们建议实验室人员和数据分析人员根据研究目标来选择合适的测序方案：

  • 如果想深入研究特定细胞类型 → 选择孔板法

  • 如果想广泛研究组织中的细胞异质性 → 选择液滴法

  • 如果预算有限 → 选择更经济且稳健的方案

  • 数据分析时要注意每种测序方案特有的偏差

如果想深入了解各种单细胞测序方案的详细比较，可以阅读Mereu等人发表的Benchmark文章。

2.5.4 单细胞vs单核测序

到目前为止，我们主要讨论的是单细胞测序方案，但实际上我们还可以选择只测序细胞核。这两种方法各有优势，让我们深入了解它们的差异。

为什么需要单核测序？ 某些组织（特别是大脑组织）在进行单细胞分析时会遇到特殊挑战：

  • 一些细胞类型在组织解离过程中特别脆弱

  • 例如：在小鼠新皮层研究中发现，快速发放的parvalbumin阳性中间神经元和投射到皮层下的谷氨酸能神经元的比例低于预期

  • 相反，非神经元细胞却表现出更强的抗性，在成年人新皮层的单细胞悬液中比例过高

单核测序的优势 ：

  1. 细胞核对机械力更耐受

  2. 可以从冷冻组织中安全分离

  3. 不需要使用组织解离酶

  4. 特别适合处理储存在组织库中的样本

关键发现 ：研究表明，细胞核的转录谱能够准确反映整个细胞的转录模式。这一发现大大增加了单核测序的实用性。

方法选择建议 ：

  • 选择单细胞还是单核测序主要取决于样本类型

  • 数据分析时要注意：组织解离能力会强烈影响可观察到的细胞类型

  • 建议实验室人员和数据分析人员在实验设计阶段就进行充分讨论

这种选择有点像在餐厅选择堂食还是外卖——没有绝对的好坏，关键是要根据具体情况（比如时间、地点、预算等）来决定。同样，选择单细胞还是单核测序，也需要根据研究目标、样本特点等具体因素来权衡。

2. 6 拓展阅读

为了更深入地理解单细胞测序实验技术，我们推荐以下论文：

1. Ziegenhain et al. (2017) "Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods"单细胞RNA测序方法的比较分析

2. Svensson et al. (2017) "Power Analysis of Single-cell RNA-sequencing Experiments"单细胞RNA测序实验的统计功效分析

3. Bakken et al. (2018) "Single-nucleus and Single-cell Transcriptomes Compared in Matched Cortical Cell Types"皮层细胞类型中单核和单细胞转录组的对比研究

4. Lafzi et al. (2018) "Guidelines for the Experimental Design of Single-cell RNA Sequencing Studies"单细胞RNA测序研究的实验设计指南

5. Mereu et al. (2020) "Benchmarking Single-cell RNA-sequencing Protocols for Cell Atlas Projects"细胞图谱项目中单细胞RNA测序方案的基准测试

6. Wang et al. (2021) "Direct Comparative Analyses of 10X Genomics Chromium and Smart-seq2"10X Genomics Chromium和Smart-seq2的直接比较

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后记

本篇对应原书的第二章（第一章为前言，为了和原书保持一致所以这里序号也标为02）作为全书正文开篇，这一章主要介绍了测序技术的理论知识，尤其是不同测序平台的优劣势对比，希望大家不要觉得过于干巴～暗号scbp02 获取英文原文及推荐阅读文献资源哦（分享有延迟，如果没收到请耐心等待）！

下篇预告：fastq原始数据处理。原文很长，可能会分为几个部分。敬请期待！

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