STAR居然有bug？？全流程详细复盘

大家爱用的比对工具STAR目前已经发布到2.7.11b版本了。然而前几天我更新后发现运行的时候的时候会报错：

Transcriptome.cpp:18:Transcriptome: exiting because of INPUT FILE error: could not open input file /geneInfo.tab

看内容是跟索引相关，难道是旧版本的索引跟新版不兼容了？复盘开始，先从头构建参考基因组吧：

下载参考基因组

首先是下载参考基因组。人和小鼠的基因组最权威的是GENCODE 。当然大家常用的的ENSEMBL，NCBI RefSeq，UCSC版本当然也大差不差，选自己喜欢的就行。

注释文件，一般推荐下第四个/第六个，“Basic Gene Annotation”：

wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_47/gencode.v47.primary_assembly.basic.annotation.gtf.gz
# unzip
gunzip https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_47/gencode.v47.primary_assembly.basic.annotation.gtf.gz

Fasta取决于你的需要了，一般情况下是下载最后一个 "Genome sequence, primary assembly"，也就是基因组。STAR默认是比对到基因组的，因为可以同时检测可变剪接。如果不关心这个，只想比对到转录组，就下载第一个Transcript Sequences。用转录组跑STAR的时候需要加上--genomeType Transcriptome

wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_47/GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz
# unzip
gunzip https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_47/GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz

构建索引

特意检查了一下官方文档，这一步代码跟之前是一样的。

STAR --runMode genomeGenerate \
--genomeDir GRCh38_genome \
--genomeFastaFiles GRCh38.primary_assembly.genome.fa \
--sjdbGTFfile gencode.v47.primary_assembly.basic.annotation.gtf \
--runThreadN 12 \
--sjdbOverhang 149 # 读长-1

完成后又检查了一下索引目录：

/Users/miana/Desktop/GRCh38_gemone
├── Genome
├── Log.out
├── SA
├── SAindex
├── chrLength.txt
├── chrName.txt
├── chrNameLength.txt
├── chrStart.txt
├── exonGeTrInfo.tab
├── exonInfo.tab
├── geneInfo.tab
├── genomeParameters.txt
├── sjdbInfo.txt
├── sjdbList.fromGTF.out.tab
├── sjdbList.out.tab
└── transcriptInfo.tab

1 directory, 16 files

确实是该有的都有了，也没有报错。那重跑一遍吧！

比对

STAR --runThreadN 12 \
         --readFilesIn sample1_R1_001.fastq.gz sample1_R2_001.fastq.gz \
         --genomeDir GRCh38_genome \
         --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
         --outSAMunmapped Within  \
         --quantMode GeneCounts  \
         --sjdbGTFfile gencode.v47.primary_assembly.basic.annotation.gtf \
         --sjdbOverhang 149 \
         --outFileNamePrefix outs \
         --readFilesCommand "gunzip -c"

然后华丽丽的又报错了。

Transcriptome.cpp:18:Transcriptome: exiting because of INPUT FILE error: could not open input file /geneInfo.tab
Solution: check that the file exists and you have read permission for this file
SOLUTION: utilize --sjdbGTFfile /path/to/annotations.gtf option at the genome generation step or mapping step

Jan 24 20:14:23 ...... FATAL ERROR, exiting

好吧，看来不是我的问题。去翻github，我发现这个问题远在2023年9月就有了：

2024年底还有人在讨论解决方案：

总结一下，问题的原因在于M芯片的不兼容 （我们mac用户招惹谁了😭），然而到现在为止还没有正式的解决方案。在网友们的集思广益以及我的尝试下，最终我还是成功了！给大家分享一下具体步骤：

debug详细过程

⚠️ 更改源代码可能导致其他未知问题，只是一个暂时的解决方案，操作请谨慎

从github下载2.5.11b测试版：

git clone https://github.com/dobinlab/STAR_pre_releases.git

下载好之后不要急着安装，先找到 ParametersGenome.cpp 这个文件，找到第27行：

transform.outYes = transform.outSAM = transform.outSJ = false;

修改为

transform.outYes = transform.outSAM = transform.outSJ = transform.outQuant = false;

再找到SharedMemory.cpp这个文件，把第109和254行的SHM_NORESERVE改成MAP_NORESERVE (不改的话在编译的时候就会出现以下报错，贴心的网友已经帮你踩过坑了，真的我哭死)

SharedMemory. cpp: In member function 'void SharedMemory::CreateAndInitSharedObject(size_t)':
SharedMemory.cpp:109:59: error: 'SHM_NORESERVE' was not declared in this scope; did you mean 'MAP_NORESERVE'?
109 | _shmID=shmget(_key, toReserve, IPC_CREAT | IPC_EXCL | SHM_NORESERVE | 0666); // _shmID = shmget(shmKey, shmSize, IPC_CREAT | SHM_NORESERVE | SHM_HUGETLB | 0666);
| ^~~~~~~~~~~~~
| MAP_NORESERVE
SharedMemory.cpp: In member function 'void SharedMemory::EnsureCounter()':
SharedMemory.cpp:254:72: error: 'SHM_NORESERVE' was not declared in this scope; did you mean 'MAP_NORESERVE'?
254 | _sharedCounterID=shmget(_counterKey, 1, IPC_CREAT | IPC_EXCL | SHM_NORESERVE | 0666);
| ^~~~~~~~~~~~~
| MAP_NORESERVE
make: *** [SharedMemory.o] Error 1

接下来就可以编译了。注意不要按照官方文档里mac的方法，那是给英特尔芯片的。

cd STAR/source
make STAR
# 加到PATH
export PATH=/path/to/STAR/:$PATH
# 或者 cp STAR /usr/local/bin

此时再运行比对定量，就不会报错了。

小提示：运行之前，还要在命令行中设置ulimit -n 2048以允许STAR同时处理多个chunk

后记

M芯片因为架构的原因，有许多软件都有兼容性的问题。但是在可以运行的情况下，我发现速度一般是远超linux服务器的。比如这次我对27个bulk RNA-seq样本用STAR比对定量（双端150bp），平均一个样本就5分钟，为了对比我还用salmon也定量了一下，感觉甚至是STAR更快，虽然salmon在内存占用方面仍然有很大的优势。以后有时间详细对比一下STAR和salmon的输出结果吧～