细胞注释：参考映射

2025年12月19日 · Analysis Notes

摘要： 通过从特征明确的参考图谱转移标签来注释细胞。使用 SingleR 进行简单投影，使用 Azimuth 进行 UMAP 引导的映射，或使用 Symphony 进行快速多参考整合。适用于存在高质量参考图谱的标准组织。

什么是参考图谱映射？

参考图谱映射 不是手动识别细胞类型，而是将注释从经过整理的图谱转移到您的查询数据中。

核心概念

您的数据（未注释） + 参考图谱（已注释） → 您的数据（已注释）

参考图谱映射概念

优势

参考图谱映射	手动注释
自动化	手动检查标记基因
一致性高	主观性强
速度快	耗时
全面性高	可能遗漏稀有类型

局限性

⚠️ 参考图谱必须包含您的细胞类型（无法发现新群体）
⚠️ 批次效应可能导致错误映射
⚠️ 质量取决于参考图谱的质量

何时使用参考图谱映射

✅ 适用于：

标准组织（PBMC、肺、脑、肿瘤微环境）
与已发表图谱进行验证
多样本的高通量注释
跨研究整合

❌ 避免在以下情况使用：

预期存在新细胞类型
参考图谱来自不同物种/技术平台
样本量小（参考信号可能淹没查询信号）

主要参考数据库

人类细胞图谱 (HCA)

链接： data.humancellatlas.org
内容： 涵盖 40+ 种组织的约 1 亿个细胞
最佳用途： 跨组织注释、发育生物学

CellxGene (Chan Zuckerberg Initiative)

链接： cellxgene.cziscience.com
内容： 带有交互式浏览器的精选单细胞数据集
最佳用途： 寻找组织特异性参考图谱、探索性分析

Azimuth 参考图谱 (Seurat)

链接： azimuth.hubmapconsortium.org
内容： 针对 PBMC、肺、肾、运动皮层等的优化参考图谱
最佳用途： 与 Seurat/Azimuth 工作流配合即用

其他资源

数据库	重点	URL
HuBMAP	人类组织图谱	hubmapconsortium.org
Tabula Sapiens	人类器官	tabula-sapiens-portal.ds.czbiohub.org
Tabula Muris	小鼠器官	tabula-muris.ds.czbiohub.org
PanglaoDB	聚合数据库	panglaodb.se

方法一：SingleR（简单快速）

最佳用途： 快速注释、Bioconductor 工作流

安装

BiocManager::install("SingleR")
BiocManager::install("celldex")  # 参考数据集

基本用法

library(SingleR)
library(celldex)

# 加载参考图谱（内置）
ref <- HumanPrimaryCellAtlasData()

# 注释您的 Seurat/SingleCellExperiment 对象
predictions <- SingleR(
  test = as.SingleCellExperiment(pbmc),
  ref = ref,
  labels = ref$label.main
)

# 添加到 Seurat 对象
pbmc$SingleR_labels <- predictions$labels
pbmc$SingleR_scores <- predictions$scores

# 可视化
DimPlot(pbmc, group.by = "SingleR_labels", label = TRUE)

可用参考图谱

# 列出可用参考图谱
celldex::listReferences()

# 常用参考图谱
ref_immune <- ImmGenData()              # 小鼠免疫细胞
ref_encode <- BlueprintEncodeData()     # 人类免疫/批量数据
ref_monaco <- MonacoImmuneData()        # 人类 PBMC
ref_hpca <- HumanPrimaryCellAtlasData() # 泛组织人类数据

精细标签与粗略标签

# 分层注释
predictions_fine <- SingleR(
  test = sce,
  ref = ref,
  labels = ref$label.fine  # 详细标签
)

predictions_coarse <- SingleR(
  test = sce,
  ref = ref,
  labels = ref$label.main  # 宽泛类别
)

方法二：Azimuth（基于 UMAP）

最佳用途： 用户友好的 Web 界面、Seurat 整合

Web 界面（无需编码）

访问 azimuth.hubmapconsortium.org
选择参考图谱（PBMC、肺、肾等）
上传 Seurat 对象 (.rds) 或计数矩阵
下载注释结果

R 工作流

library(Seurat)
library(Azimuth)

# 安装参考图谱
InstallData("pbmcref")

# 运行 Azimuth
pbmc <- RunAzimuth(pbmc, reference = "pbmcref")

# 查看转移的标签
DimPlot(pbmc, group.by = "predicted.celltype.l2", label = TRUE)

# 检查置信度分数
FeaturePlot(pbmc, features = "predicted.celltype.l2.score")

可用的 Azimuth 参考图谱

参考图谱	组织	分辨率
pbmcref	PBMC	3 个层级 (L1, L2, L3)
lungref	肺	细胞状态 + 亚型
kidneyref	肾	发育 + 成年
motorcortexref	脑	神经元亚型
pancreas	胰腺	内分泌 + 外分泌

方法三：Symphony（快速多参考整合）

最佳用途： 大型数据集、批次整合、多参考图谱

安装

devtools::install_github("immunogenomics/symphony")

构建参考图谱

library(symphony)

# 从 Seurat 对象构建
ref_obj <- buildReferenceFromSeurat(
  seurat_obj,
  verbose = TRUE,
  do_normalize = TRUE,
  do_umap = TRUE
)

# 保存以供重用
saveRDS(ref_obj, "my_reference.rds")

映射查询数据

# 加载参考图谱
ref <- readRDS("my_reference.rds")

# 映射查询数据
query_mapped <- mapQuery(
  exp_query = query_seurat,
  ref_obj = ref,
  vars = c("batch", "donor"),  # 校正批次效应
  verbose = TRUE
)

# 转移标签
query_seurat$predicted_celltype <- query_mapped$meta_data$cell_type

方法四：Seurat v5 参考图谱映射

转移标签

library(Seurat)

# 在查询和参考数据间寻找锚点
anchors <- FindTransferAnchors(
  reference = reference_seurat,
  query = query_seurat,
  dims = 1:30,
  reference.reduction = "pca"
)

# 转移细胞类型标签
predictions <- TransferData(
  anchorset = anchors,
  refdata = reference_seurat$celltype,
  dims = 1:30
)

query_seurat$predicted_celltype <- predictions$predicted.id
query_seurat$prediction_score <- predictions$prediction.score.max

# 可视化
DimPlot(query_seurat, group.by = "predicted_celltype", label = TRUE)
VlnPlot(query_seurat, features = "prediction_score", group.by = "predicted_celltype")

转移 UMAP 嵌入

# 将查询数据投影到参考 UMAP 上
query_seurat <- MapQuery(
  anchorset = anchors,
  reference = reference_seurat,
  query = query_seurat,
  refdata = list(celltype = "celltype"),
  reference.reduction = "pca",
  reduction.model = "umap"
)

# 在参考 UMAP 上绘图
DimPlot(query_seurat, reduction = "ref.umap", group.by = "predicted.celltype")

预测结果的质量控制

检查置信度分数

# SingleR
hist(predictions$scores, main = "Prediction Scores")

# Azimuth/Seurat
VlnPlot(pbmc, features = "predicted.celltype.score", pt.size = 0)

# 标记低置信度预测
pbmc$confident <- pbmc$predicted.celltype.score > 0.5
table(pbmc$confident)

比较不同方法

# 运行多种方法
pbmc$singleR <- singleR_predictions$labels
pbmc$azimuth <- azimuth_predictions
pbmc$seurat <- seurat_predictions

# 混淆矩阵
table(SingleR = pbmc$singleR, Azimuth = pbmc$azimuth)

# 共识注释（所有方法一致）
pbmc$consensus <- ifelse(
  pbmc$singleR == pbmc$azimuth & pbmc$azimuth == pbmc$seurat,
  pbmc$singleR,
  "Ambiguous"
)

使用标记基因验证

# 检查预测的 T 细胞是否表达 CD3D
VlnPlot(pbmc, features = "CD3D", group.by = "predicted.celltype")

# 按预测类型检查经典标记基因
markers_to_check <- c("CD3D", "CD14", "MS4A1", "NKG7")
DotPlot(pbmc, features = markers_to_check, group.by = "predicted.celltype")

进阶：跨模态映射

ATAC-seq 到 RNA-seq

library(Signac)

# 寻找转移锚点 (ATAC → RNA)
anchors <- FindTransferAnchors(
  reference = rna_seurat,
  query = atac_seurat,
  reduction = "cca",
  features = VariableFeatures(rna_seurat)
)

# 转移标签
predictions <- TransferData(
  anchorset = anchors,
  refdata = rna_seurat$celltype,
  weight.reduction = atac_seurat[["lsi"]]
)

atac_seurat$predicted_celltype <- predictions$predicted.id

多组学整合 (CITE-seq)

# 从参考数据转移蛋白表达
protein_predictions <- TransferData(
  anchorset = anchors,
  refdata = GetAssayData(reference, assay = "ADT"),
  weight.reduction = "pca"
)

query[["ADT_predicted"]] <- CreateAssayObject(data = protein_predictions)

故障排除

预测分数低

原因：

参考图谱不包含您的细胞类型
查询与参考数据间存在批次效应
数据质量差

解决方法：

# 尝试不同的参考图谱
# 或使用更宽松的阈值
predictions_filtered <- predictions[predictions$scores > 0.3, ]

稀有类型注释错误

原因： 参考图谱缺乏稀有群体
解决方法： 结合参考图谱映射与手动整理：

# 自动注释常见类型，手动检查稀有聚类
pbmc$final_celltype <- pbmc$predicted.celltype
pbmc$final_celltype[pbmc$seurat_clusters == 12] <- "Manual: Rare Type"

参考图谱差异过大（物种、技术平台）

解决方法： 使用基于同源性的工具：

# 将小鼠基因转换为人类基因
library(orthogene)
converted <- convert_orthologs(gene_df, gene_input = "rownames", 
                               input_species = "mouse", 
                               output_species = "human")

方法比较

方法	速度	准确性	整合性	最佳用途
SingleR	快	高	Bioconductor	快速注释
Azimuth	中等	非常高	Seurat	用户友好、高质量参考图谱
Symphony	非常快	高	Harmony 基础	大型队列、多批次
Seurat Transfer	中等	高	Seurat	自定义参考图谱

资源

SingleR 教程： bioconductor.org/packages/SingleR
Azimuth 应用： azimuth.hubmapconsortium.org
Symphony 论文： Nature Commun 2021
参考图谱映射综述： Cell 2024

另请参阅：

Cell Annotation