BD Rhapsody 与 Seven Bridges

摘要： BD Rhapsody 采用基于微孔板的单细胞捕获技术，相比液滴法，对脆弱细胞具有更高的捕获效率。可通过云端平台 Seven Bridges（简单，付费）或本地 Rhapsody 序列分析流程（灵活，免费）分析数据。

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什么是 BD Rhapsody？

10x Genomics 使用微流控液滴技术，而 BD Rhapsody 采用 微孔板 + 磁珠 策略。

工作原理

1. 捕获： 细胞通过重力沉降到约 200,000 个微孔中。
2. 磁珠： 带有条形码的磁珠捕获 mRNA。
3. 裂解： 细胞被裂解，mRNA 与磁珠杂交。
4. 回收： 磁珠通过磁性回收用于测序。

BD Rhapsody 与 10x Genomics 对比

特性	BD Rhapsody (微孔板)	10x Genomics (液滴)
捕获效率	高 (>80%)	中等 (~50-65%)
细胞应激	低 (重力沉降)	中等 (微流控压力)
输入细胞数	100 - 40,000+	500 - 20,000
脆弱细胞	✅ 优秀 (如中性粒细胞)	⚠️ 具有挑战性
多组学	AbSeq (抗体)	CITE-seq (抗体)
成本	每个样本较高	中等

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方案一：Seven Bridges (云端平台)

Seven Bridges 是 BD 的官方云端合作伙伴。推荐给初学者或没有高性能计算 (HPC) 访问权限的用户。

工作流程

1. 创建账户： 在 Seven Bridges Genomics 注册。
2. 上传数据： 上传你的 FASTQ 文件 (R1, R2)。
3. 选择流程： 选择 "BD Rhapsody™ Sequence Analysis Pipeline"。
4. 配置：
   • 参考基因组： 选择人/鼠。
   • AbSeq： 如果使用了抗体标签，请开启此选项。
   • 预估细胞数： 输入预期的细胞数量。
5. 运行： 提交任务。

优点：

• 无需硬件
• 图形用户界面
• 保证可重复的环境

缺点：

• 付费服务 (计算点数)
• 大文件上传/下载耗时

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方案二：本地流程 (命令行)

对于高级用户，可以使用 Docker 或 Singularity 在本地运行该流程。这是免费的（硬件成本除外）。

先决条件

• 内存： 32GB (最低) 至 128GB (推荐)
• CPU： 8+ 核心
• 已安装 Docker 或 Singularity

1. 获取流程镜像

BD 以 Docker 镜像形式分发该流程。

docker pull bdbiosciences/rhapsody

2. 下载参考基因组

你需要 BD 特定格式的参考基因组。

# 示例：下载人类参考基因组
wget https://bd-rhapsody-public.s3.amazonaws.com/reference_genomes/human_reference.tar.gz
tar -xvf human_reference.tar.gz

3. 运行流程

该流程需要一个配置 YAML 文件（或大量的命令行参数）。

# 创建 config.yml
Reads:
  - Read1: sample_R1.fastq.gz
    Read2: sample_R2.fastq.gz
Reference:
  - /path/to/human_reference
AbSeq: false
PutativeCellCount: 5000

使用 Docker 运行：

docker run -v $PWD:$PWD \
  bdbiosciences/rhapsody \
  rhapsody pipeline \
  --config config.yml \
  --out-dir ./output

关键参数

参数	描述
--exact-cell-count	强制指定特定的细胞数量 (例如，5000)
--putative-cell-call	算法：mRNA (默认) 或 Basic
--subsample	为测试而下采样读取 (0.0-1.0)
--generate-bam	输出 BAM 文件 (对 RNA 速率分析有用)

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输出文件

运行结束后，查找以下文件：

文件	描述
_RSEC_MolsPerCell.csv	主计数矩阵 (校正后的计数)
_DBEC_MolsPerCell.csv	原始计数 (基于分布的错误校正)
_Metrics_Summary.csv	质控指标 (映射的读数，检测到的细胞)
_Pipeline_Report.html	可视化质控报告

关于 RSEC 与 DBEC 的说明：

• RSEC (递归替换错误校正)： 更激进，会合并相似的 UMI。将此用于差异表达分析。
• DBEC (基于分布的错误校正)： 较不激进。

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将数据加载到 Seurat/Scanpy

BD 的输出是 CSV 文件 (不同于 10x 的 mtx/tsv 格式)。

Seurat (R):

library(Seurat)

# 读取 CSV
counts <- read.csv("Sample_RSEC_MolsPerCell.csv", row.names = 1, comment.char = "#")

# 转置 (Seurat 期望 基因 x 细胞)
counts <- t(counts)

# 创建对象
obj <- CreateSeuratObject(counts, project = "BD_Rhapsody")

Scanpy (Python):

import scanpy as sc
import pandas as pd

# 读取 CSV
adata = sc.read_csv("Sample_RSEC_MolsPerCell.csv")

# BD 文件通常以基因为列，Scanpy 期望基因为列 (因此如果 CSV 是 细胞 x 基因，则无需转置)
# 检查形状！
print(adata.shape) 

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故障排除

"检测到的细胞太少"

原因： PutativeCellCount 设置过高或细胞受损。
解决方法：

• 检查 HTML 报告中的 "Knee Plot"。
• 降低 --putative-cell-call 阈值。

"低映射率"

原因： 错误的参考基因组或文库质量差。
解决方法：

• 确保参考基因组与物种匹配 (如果使用了 AbSeq 标签，也需匹配)。
• 使用 FastQC 检查 FASTQ 质量。

"缺少 AbSeq 信号"

原因： 错误的 AbSeq 参考 CSV 文件。
解决方法：

• AbSeq 需要一个单独的 FASTA/CSV 文件来定义抗体条形码。确保该文件与你的抗体面板完全匹配。

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另请参阅：

• 运行 Cell Ranger
• Cell Ranger 的替代方案：STARsolo